Biophotonik

Fluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie beruht auf demselben Prinzip wie die Lichtmikroskopie, aber anstelle von Absorption, Streuung oder Reflexion von Licht zu beobachten, wird die Fluoreszenz einer Probe analysiert. Dabei wird eine fluoreszierende Probe mit Licht einer bestimmten Wellenlänge einen angeregten Zustand angeregt. Während der Relaxation emittiert die Probe Licht einer bestimmten Wellenlänge, das durch Farbfilter vom Anregungslicht getrennt und detektiert wird. In der Fluoreszenzmikroskopie können je nach Anwendung und Art der Probe verschiedene Methoden und Mikroskoparten verwendet werden. Die Proben können dabei intrinsisch fluoreszierend sein wie Farbstoffe oder Halbleiter, allerdings werden in den meisten Proben Farbstoffe verwendet, die an bestimmte Strukturmerkmale binden. So können mit verschiedenen Farbstoffen in einer Probe verschiedene Strukturen unterschiedlich gefärbt und sichtbar gemacht werden. Dies macht die Fluoreszenzmikroskopie zu einer überlegenen Technik für biologische Proben, da diese oft Strukturen aufweisen, die mit einem Lichtmikroskop nicht sichtbar sind. Die Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie kann sehr unterschiedlich sein, sie reicht von der Grundlagenforschung über die Materialwissenschaften bis hin zur Biologie und Pharmazie.

Die Grundkomponenten jedes herkömmlichen Fluoreszenzmikroskops sind in der Regel gleich. Eine Probe wird mit Licht beleuchtet, gleichzeitig wird die entstehende Fluoreszenz detektiert. Die Basis eines Fluoreszenzmikroskops ist eine Lichtquelle, in der Regel Weißlichtlampen, LEDs oder ein Laser. Mit Hilfe eines Anregungsfilters kann die gewünschte Anregungswellenlänge isoliert werden. Nachdem das Anregungslicht mit einem Objektiv auf die Probe fokussiert wurde, wird die resultierende Fluoreszenz mit demselben Objektiv aufgefangen und durch einen dichroitischen Spiegel geführt, um Anregungs- und Emissionslicht zu trennen. Das Emissionslicht wird in den Detektionspfad transmittiert, während das restliche Anregungslicht reflektiert wird. Um eine korrekte Detektion zu gewährleisten, kann ein Emissionsfilter verwendet werden. Die Größe des beleuchteten Bereichs der Probe hängt von der Lichtquelle und der Fokussierung des Lichtstrahls ab.

Im Folgenden werden die gebräuchlichsten Methoden der Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt, und die entsprechenden Komponenten sind in den Produktkategorien zu finden.




Konfokalmikroskopie

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Die Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie wird durch die Spotgröße bestimmt, die im Allgemeinen durch die Beugungsgrenze nach Ernst Abbe auf etwa die Hälfte der Wellenlänge des verwendeten Lichts begrenzt ist.

Insbesondere bei dickeren Proben trifft dies jedoch nicht zu. Ein Grund dafür ist die Sekundärfluoreszenz, die durch das angeregte Probenvolumen emittiert wird. Die Sekundärfluoreszenz kann die Probenmerkmale in der Fokusebene verdecken, insbesondere bei dickeren Proben (z. B. biologischen Proben) gehen bei der Abbildung viele Details verloren.

Im Gegensatz zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie beleuchtet ein Konfokalmikroskop nur einen kleinen Bereich der Probe und verwendet darüber hinaus eine Lochblende, um Licht aus Bereichen, die nicht im Fokus liegen, zu eliminieren. Die Bilder werden erzeugt, indem die Probe mit einer hohen Präzision mithilft eines Positioniersystems abgerastert wird. Die Verwendung einer Lochblende ermöglicht die Kontrolle der Tiefenschärfe und verbessert den Kontrast und die Schärfe der aufgenommenen Bilder. Aufgrund der geringen Hintergrundfluoreszenz und des besseren Signal-Rausch-Verhältnisses ist das Konfokalmikroskop anderen Techniken überlegen. Durch die Aufnahme mehrerer 2D-Bilder in unterschiedlichen Tiefen der Probe können mit einem Konfokalmikroskop auch 3D-Strukturen nachgebildet werden. Die Vorteile der Konfokalmikroskopie liegen auf der Hand: Durch die Eliminierung von Licht aus Bereichen, die nicht im Fokus liegen, werden qualitativ hochwertige Bilder erzeugt und das Scannen in drei Dimensionen ermöglicht. Dennoch hat die Konfokalmikroskop einige Nachteile. Da jedes Bild abgerastert werden muss, ist diese Aufnahmetechnik relativ langsam. Außerdem wird ein großer Teil der Signalintensität durch die Lochblende blockiert, weshalb lange Belichtungszeiten erforderlich sind. Nichtsdestotrotz ist die konfokale Mikroskopie eine leistungsstarke Technik, die in wissenschaftlichen und industriellen Anwendungen in der Biologie, der Halbleitertechnik und der Materialwissenschaft beliebt ist.




Multiphotonenmikroskopie

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Die Multiphotonenmikroskopie ist eine Unterkategorie der Fluorenzenzmikroskopie, die aber auf demselben Prinzip beruht. Bei der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie ist die Anregungswellenlänge kürzer als die Emissionswellenlängen und damit höher energetischer. Der Grund dafür ist der energetische Unterschied zwischen dem Grundzustand und dem angeregten Zustand des beobachteten Systems. Die Energie der Photonen muss mindestens so groß wie diese Energielücke sein, um das System anzuregen. Danach zerfällt der angeregte Zustand und ein Photon mit einer Energie, die der energetischen Lücke entspricht, wird emittiert. Im Falle der Zwei-Photonen-Mikroskopie hat das Anregungslicht eine größere Wellenlänge als das emittierte Licht und somit eine geringere Energie. Um die Energielücke zum angeregten Zustand dennoch zu überwinden, ist die gleichzeitige Absorption von zwei Photonen erforderlich. Die Zwei-Photonen-Absorption ist ein nichtlinearer optischer Prozess und somit proportional zum Quadrat der Lichtintensität ist.


Die Grundkomponenten eines Zwei-Photonen-Mikroskops sind mit denen eines Fluoreszenzmikroskops vergleichbar: Lichtquelle, Anregungsfilter, Fokussierlinse oder Objektiv, dichroitischer Spiegel, Emissionsfilter und ein Detektor. Die Lichtquelle ist jedoch in der Regel ein gepulster Femtosekundenlaser, um hohe Pulsenergien für den Zwei-Photonen-Absorptionsprozess zu gewährleisten. Die gängigsten Zwei-Photonen-Anregungsquellen verwenden Wellenlängen im Bereich von 700-1200 nm. Die Wahrscheinlichkeit einer Zwei-Photonen-Absorption ist sehr gering; daher ist eine hohe Laserintensität erforderlich. Des Weiteren kann die Anregung kann nur im Brennpunkt des Laserstrahls erfolgen, was zu einer hohen Auflösung führt, da keine Bereiche außerhalb des Brennpunkts angeregt werden.

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Langwelliges Anregungslicht weist weitere Vorteile auf. Der wichtigste ist die Eindringtiefe von IR-Licht in organische Materie. Während sichtbares Licht eine Eindringtiefe von 50-80 µm hat, kann IR-Licht in idealen Systemen bis zu 1000 µm erreichen. Dies ermöglicht die Abbildung von lebendem Gewebe, was umfangreiche Forschungen in den Neurowissenschaften, der Krebsforschung und weiteren physiologischen Bereichen ermöglicht. Ein weiterer Vorteil ist die Verringerung des Hintergrundsignals aufgrund der lokalisierten Anregung und der Effekt des Photobleachings wird reduziert. Durch die Anwendung dreidimensionaler Scanparameter können hochauflösende 3D-Bilder aufgenommen werden. Allerdings dürfen die Nachteile der Zwei-Photonen-Anregung nicht außer Acht gelassen werden. Sehr hohe Laserintensitäten können Nebenreaktionen und Degradation der Probe hervorrufen.

Neben der Zwei-Photonen- kann auch die Drei-Photonen-Mikroskopie eingesetzt werden. Wie der Name schon sagt, müssen dabei drei Photonen gleichzeitig absorbiert werden, um eine Probe anzuregen und Fluoreszenz hervorzurufen. Die dabei verwendete Wellenlänge liegt in der Regel bei 1200 nm oder länger. Dadurch wird die Eindringtiefe des Lichts noch weiter erhöht und die Anregung tief im organischen Material ermöglicht. Kürzlich konnten Wissenschaftler mit Hilfe der Drei-Photonen-Mikroskopie die Gehirnfunktionen durch einen intakten Mäuseschädel hindurch abbilden.

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Lichtscheibenmikroskopie

Eine weitere, oft von Biologen bevorzugte Technik der Fluoreszenzmikroskopie ist die sogenannte Lichtscheibenmikroskopie. Im Gegensatz zu anderen Fluoreszenzmikroskopieverfahren wird die Probe senkrecht zum Detektionsweg beleuchtet. Außerdem wird anstelle eines fokussierten Laserpunktes ein lamellenförmiger Laserstrahl, eine so genannter Lichtscheibe, verwendet. Eine Lichtscheibe wird entweder durch Fokussierung des Lichts in einer Dimension mit Hilfe einer Zylinderlinse oder durch schnelles Oszillieren eines Laserstrahls in eine Richtung erzeugt, wodurch eine virtuelles Lichtscheibe entsteht. Der Probenbereich innerhalb der Lichtscheine wird angeregt, und die daraus resultierende Emission wird mit einem Objektiv senkrecht zur Lichtscheibe detektiert und auf einen Detektor geleitet. Dabei ist es möglich, die Anregungs- und Emissionspfade in den Probenpuffer einzutauchen. Dies ermöglicht eine zusätzliche Kontrolle über die Umgebungsbedingungen der Probe während des Experiments.

Der Vorteil der Lichtblattmikroskopie besteht dbiophotonics-microscopy-light_DE.pngarin, dass nur das Probenvolumen in der Fokusebene des Detektionsobjektivs angeregt wird. Dadurch wird das Hintergrundsignal drastisch reduziert, da kein Licht aus Bereichen außerhalb des Fokusses vorhanden ist, und die räumliche Auflösung des Abbildungsprozesses erhöht. Außerdem wird die Gesamtlichtschädigung reduziert, da nur die Fokusebene beleuchtet wird. Des Weiteren ist die Aufnahmezeit für Bilder wesentlich geringer als bei Punktrastermikroskopen, da ein ganzes 2D-Bild auf einmal aufgenommen werden kann. Durch räumliches Scannen einer Probe kann ein 3D-Modell erstellt werden. Durch die Trennung von Anregungs- und Emissionspfad im Mikroskop, sind Kombinationen von Anregungsregimen möglich, was eine multimodale Bildgebung erlaubt.

Es gibt zahlreiche Erweiterungen der herkömmlichen Lichtscheibenmikroskopie, wie z. B. die Beleuchtung mit zwei Lichtscheiben zur Verringerung von Schattenartefakten oder die Kombination mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie oder superhochauflösenden Techniken. Darüber hinaus kann die Lichtscheibenmikroskopie mit verschiedenen Anregungswellenlängen verwendet werden und erlaubt auch eine Multiphotonenanregung. Die umfangreichen Möglichkeiten der Lichtscheibenmikroskopie machen sie zu einer schnell wachsenden Technik mit großem Zukunftspotenzial.

Dies sind nur die Hauptvarianten der Fluoreszenzmikroskopie, es gibt jedoch zahlreiche Erweiterungen und Variationen, z.B. superhochauflösende Techniken (z. B. STED). Ob Sie nun selbst ein Mikroskop bauen wollen oder nur einen zusätzlichen Filter benötigen, wir helfen Ihnen gerne bei der Konstruktion und der richtigen Auswahl.

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